PROCEDIMIENTO EN EL SISTEMA TaqScreen MPX Test cobas s201
1. Pooling automatizado de las muestras con el pipeteador HAMILTON Microlab STAR IVD
El operador deposita en el equipo pipeteador HAMILTON Microlab® STAR IVD la gradilla que contiene las muestras ya ordenadas, y en forma automatizada, el equipo realiza el pipeteo de cada una de las muestras de donantes individuales para formar los pooles. El sistema realiza la transferencia de alícuotas, genera los pooles, las serotecas (remanentes que se guardan para posterior uso) y realiza el pipeteo de los controles de cada una de las pruebas.
Todas las muestras se procesarán en pooles de 6 donadores, a excepción de los casos de urgencia que se procesarán de forma individual siempre y cuando hayan sido autorizados por el Director General del Laboratorio.
| Eficiencia | Muestras | Pooles (6x) | %Eficiencia |
|---|---|---|---|
| Máxima | 108 | 18 | 100% |
| Equilibrio | 96 | 16 | 88.8% |
| Mínima | 60 | 10 | 55.5% |
El sistema cobas s 201 está diseñado para procesar muestras en Lotes, es decir que un conjunto de muestras y controles se pipetean, extraen, amplifican y detectan conjuntamente.
Cuando finaliza el pipeteo de un Lote en el pipeteador HAMILTON Microlab® STAR IVD, toda la bandeja de muestras y controles se transfiere al equipo COBAS® AmpliPrep para realizar el siguiente proceso.
2. Preparación automática de las muestras con el equipo COBAS AmpliPrep
Las muestras (que pueden contener ácidos nucléicos de los virus) y los controles, utilizadas como control del proceso de preparación y amplificación/detección de las muestras, se procesan simultáneamente.
Para la preparación (extracción de los ácidos nucléicos) de las muestras, se requieren de 5 pasos secuenciales en el equipo COBAS® AmpliPrep:
a) Digestión: La solución de proteasa digiere las proteínas para propiciar la lisis, inactivar las nucleasas y facilitar la liberación de ARN y ADN de las partículas víricas.
b) Lisis: La adición de reactivo de lisis a las muestras provoca una lisis de las partículas virales y la inactivación de las nucleasas, mediante la desnaturalización de las proteínas de la cápside.
c) Fijación: El ARN y el ADN se liberan y se protegen simultáneamente de las nucleasas. Los ácidos nucléicos liberados se unen a la superficie de sílice de las micropartículas magnéticas añadidas. Esto se produce principalmente a causa de la carga positiva neta en la superficie de las micropartículas magnéticas y la carga negativa de los ácidos nucleicos en la concentración de sal caotrópica junto con la fuerza iónica de la reacción de lisis.
d) Limpieza: Se agrega un reactivo de lavado que elimina las sustancias no unidas a las micropartículas magnéticas, las impurezas como las proteínas, los restos de células y potenciales inhibidores de la PCR (hemoglobina, etc.), y reduce la concentración de sal.
e) Recuperación: Los ácidos nucléicos purificados se liberan de las micropartículas magnéticas con ayuda de temperatura elevada y la solución tampón de elución. El material genético recuperado se colecta y utiliza para la reacción de amplificación y detección.
3. Amplificación automatizada del ácido nucléico con el analizador COBAS® TaqMan96
Después del aislamiento de los ácidos nucleicos purificados a partir de los plasmas de donadores, se realiza la amplificación y detección simultanea de: HIV-1 (grupos M y O), ARN de HIV-2 y HCV, ADN de HBV y ARN de IC (Internal Control).
Una vez activada mediante la adición de acetato de manganeso, la reacción de amplificación múltiple (Cobas TaqScreen MPX Master Mix) permite la transcripción inversa (para dianas de ARN), seguida de la amplificación por PCR de regiones muy conservadas de HIV-1 (grupos M y O), ARN de HIV-2 y HCV, ADN de HBV y ARN del IC utilizando primers (secuencias) específicos para cada uno de los blancos. Esta reacción de amplificación permite que aunque en las muestras existan muy poquitas copias de los genomas virales, estos se replican millones de veces para permitir su detección.
4. Detección automatizada en tiempo real de productos de PCR mediante el analizador COBAS TaqMan
La detección simultánea de ácidos nucléicos amplificados se consigue mediante la generación de sondas fluorescentes específicas para los genomas virales y sondas fluorescentes específicas del IC, que también esta presente en la mezcla maestra.
Para esto, se utilizan dos marcadores fluorescentes: uno etiqueta la sonda que identifica en forma independiente al IC y el otro marca todas las sondas específicas de los blancos viralesdeHIV-1 (grupos M y O), HIV-2, HCV, HBV, lo que permite la identificación combinada (multiplex) de los genomas virales en la misma reacción; como se explica a continuación.
Durante la amplificación por PCR, la elevada temperatura durante el ciclo de desnaturalización, permite que la doble cadena de los ácidos nucléicos virales y la del IC se abran para formar ADN monocatenario. Cuando hay material viral amplificado, las sondas de oligonucleótidos fluorescentes específicas se unen (hibridan) a las cadena sencillas del ADN amplificado. La unión de la sonda a su blanco genera un sistema que emite fluorescencia, la cual genera una señal de REACTIVIDAD, las muestras que no contienen material genético para amplificar e hibridar con las sondas no permiten la unión de estas y por lo tanto no hay fluorescencia presente en la reacción, lo que genera un resultado NO REACTIVO. El IC debe generar un resultado VALIDO en cualquiera de los casos, incluyendo el control negativo.
Los procesos de amplificación, hibridación y detección se producen simultáneamente en la reacción. Y la diferencia del fluoróforo para los blancos virales o para el IC, permite diferenciar la señal de fluorescencia emitida por el control de la señal fluorescente emitida por las muestras.
5. Gestión automatizada de datos mediante el programa PDM.
El programa Roche PDM Data Manager permite al usuario revisar e informar de los resultados. Roche PDM Data Manager asigna resultados a todos los ensayos como no reactivos, reactivos o no válidos. Además de recuperar y examinar los resultados de la PCR, el programa Roche PDM Data Manager permite al usuario imprimir informes, buscar resultados, aceptar resultados de donantes y si se desea, transmitir los resultados a un SIL.